隨著人們生活水平的提高、生活方式的改變, 非酒精性脂肪肝病（NAFLD）也呈升高的趨勢，大量研究顯示NAFLD患者具有肥胖、脂代謝紊亂、高血壓和糖代謝異常等胰島素抵杭（IR）的特征[1][2]。由于對NAFL缺乏可靠的特異性治療方法，目前多采用綜合治療策略，主要包括：生活方式干預、減輕體重和調(diào)脂治療。西醫(yī)近年來應用胰島素增敏劑，如二甲雙胍、噻唑烷二酮類藥物，抗氧化治療，顯示了一定的療效。
中醫(yī)認為NAFLD系特異性體質(zhì)的人群長期飲食失常（如過食肥甘）與體力活動減少等共同作用使人體氣化失常、濁毒積聚，進而阻礙氣血運行，影響臟腑功能所致。宜從濁毒論治，解毒化濁、調(diào)氣活血。所以選用具有清熱燥濕,瀉火解毒的黃連、黃柏，消積化濁，健運脾胃的雞內(nèi)金、山楂，活血化瘀的丹參和健脾疏肝的枳殼等組方。由此六味藥等組成的化濁顆粒在臨床試用后具有良好的調(diào)節(jié)血脂、血糖異常和改善胰島素抵抗（IR）等作用。本實驗旨在應運已被臨床證實具有明顯降低血脂、改善胰島素抵抗（IR）、提高NAFLD患者生活質(zhì)量的中藥制劑化濁顆粒 ，通過研究其對非酒精性脂肪肝病大鼠模型的干預來探討中藥改善NAFLD或IR的作用機理。為開發(fā)新藥提供理論依據(jù)。
一、材料與方法
1.研究對象
選SPF級Wistar大鼠50只，雌雄各半，體重約為200?20克，由甘肅中醫(yī)學院SPF級動物實驗中心提供。基礎飼料適應性喂養(yǎng)1周后，將50只大鼠按體重、性別重編號，以隨機數(shù)字表法抽取8只為A組：空白組，用基礎飼料喂養(yǎng)（總熱量15.335J/g，碳水化合物熱卡占53%，脂肪熱卡占9%，蛋白質(zhì)熱卡占20%）；其余42只均喂以高脂飼料[3]（膽固醇2%，豬油10%，基礎飼料88%）。兩組均在SPF實驗室喂養(yǎng)，自由飲水。至第8周末,大鼠禁食12h，隨機處死高脂飼料組大鼠2只（雌雄各一只），取出肝臟進行肝組織切片HE染色以確認模型制備成功。剩余的40只高脂飼料組大鼠按隨機數(shù)字表，分為B組：模型組10只；C組：羅格列酮組10只；D組：化濁顆粒高劑量組10只；E組：化濁顆粒低劑量組10只。B、C、D、E各組均繼續(xù)喂以高脂飼料4周，實驗期間觀察體重、飲食及尿量。
2.實驗方法
對造模成功的模型對照組，羅格列酮治療組，化濁顆粒高劑量治療組，化濁顆粒低劑量治療組四組及空白組，第8周，各組動物分別灌胃藥物或生理鹽水，每日一次，給藥按人與大鼠體表面積比折算成等效劑量。空白組、模型組分別每日灌胃等劑量的生理鹽水；羅格列酮組每日灌胃羅格列酮溶液（0.36mg/kg）；化濁顆粒高、低劑量治療組分別每日灌胃等體積化濁顆粒溶液（2.025g/kg和0.675g/kg）。
2.1第12周末，稱重，隔夜禁食12h，脫臼處死所有大鼠，股動脈采血，以3500 r/min離心10 min，分離血清，于-25℃冰箱內(nèi)保存以檢測TC、TG、FFA、FPG、FINS及TNF-α含量。并計算IRI（HOMA-IR)：HOMA-IR=(FPG?FINS)/22.5。并迅速取出肝臟，稱量其濕重，以用來計算其肝臟指數(shù)，然后從每只大鼠肝臟左葉切取兩部分，一部分放置-70℃低溫冰箱保存?zhèn)溆茫徊糠钟?%甲醛固定以作病理組織檢查用。
2.2 檢測：FPG、TG、TC在ALCYON300型全自動生化分析儀上測定；FFA按酶比色法分析試劑盒說明書測定； FINS及TNF-α水平，按放免分析試劑盒說明書測定。
2.3 統(tǒng)計學處理：采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件處理。技術資料所有數(shù)據(jù)用 ?s 表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及配對T檢驗，P＜0.05或P＜0.01為有統(tǒng)計學意義。
二、結 果
1.化濁顆粒對NAFLD大鼠體重和肝臟指數(shù)的影響
由表1可以看出，經(jīng)化濁顆粒高劑量組治療后大鼠體重降低，與治療前有顯著性差異（P<0.01），其余各組治療后體重均增高。化濁顆粒組，羅格列酮組與模型對照組比較，肝指數(shù)均降低，都具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；化濁顆粒高劑量組與羅格列酮比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
表1 化濁顆粒對非酒精性脂肪肝病大鼠體重和肝指數(shù)的影響 ( ?s)
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組別
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動物數(shù)量
（N）
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體重（Weight，g）
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肝指數(shù)
（%）
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治療前
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治療后
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空白對照組
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8
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324.21?77.64
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340.54?85.47
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3.03?0.11
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模型對照組
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9
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343.28?96.23
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358.8?100.74
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4.78?0.17*
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羅格列酮組
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9
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336.30?76.83
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354.21?76.94
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3.80?0.12△
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化濁顆粒高劑量組
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8
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333.70?68.61
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329.88?67.46*
|
3.81?0.13△
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化濁顆粒低劑量組
|
8
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324.79?73.52
|
350.63?88.64
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4.21?0.16△▲
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注：與治療前相比*P<0.01。與空白組比較*P<0.01；與模型組比較△P<0.01；與羅格列酮組比較▲P <0.01。
2.化濁顆粒對NAFLD大鼠血脂的影響
由表2可以看出，經(jīng)治療后化濁顆粒高、低劑量組、羅格列酮組與模型組比較，大鼠血清TG均有顯著性差異（P＜0.01或P<0.05），說明各藥物組均治療有效；化濁顆粒高劑量組與羅格列酮組降低TG作用相當，均優(yōu)于化濁顆粒低劑量組。與模型組比較，化濁顆粒高劑量組和羅格列酮組血清TC均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或P<0.05），而化濁顆粒低劑量組無顯著性差異（P>0.05），說明化濁顆粒低劑量組在降低TC方面效果不佳。
表2 各組大鼠間TG、TC比較（ ?s）
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組別
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動物數(shù)量
（N）
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TG
(mmol/L)
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TC
(mmol/L)
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空白對照組
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8
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1.338?0.224
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3.125?0.324
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模型對照組
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10
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4.858?0.803*
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7.577?1.045*
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羅格列酮組
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10
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2.929?0.416△
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5.977?0.852△
|
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化濁湯高劑量組
|
10
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3.325?0.421△
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6.684?0.968△△
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|
化濁湯低劑量組
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10
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3.989?0.507△△
|
6.813?0.917▲
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注：與空白對照組比較*P<0.01；與模型組比較△P<0.01，△△P<0.05；與羅格列酮組比較▲P＞0.05
3.化濁顆粒對NAFLD大鼠FFA及TNF-α影響
由表3可以看出，模型組與空白組大鼠血清FFA及TNF-α均有顯著性差異(P＜0.01)。治療后化濁顆粒組，羅格列酮組與模型組血清FFA、TNF-α比較有顯著性差異(P＜0.01)，說明各治療組均能降低NAFLD大鼠血清FFA 、TNF-α水平；化濁顆粒低劑量組與羅格列酮組比較有顯著性差異（P<0.01或P<0.05），化濁顆粒高劑量組與羅格列酮組比較無統(tǒng)計學意義（P>0.05），說明化濁顆粒高劑量組與羅格列酮作用相似，均優(yōu)于化濁顆粒低劑量組。
表3各組大鼠間FFA、TNF-α的比較（ ?s）
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組別
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動物數(shù)
（N）
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游離脂肪酸
（FFA，μmol/L）
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腫瘤壞死因子
(TNF-α，ng/L)
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空白對照組
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8
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5.0658E2?98.017
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0.793?0.109
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模型對照組
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10
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8.3501E2?76.179*
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1.828?0.127*
|
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羅格列酮組
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10
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5.4911E2?50.821△
|
1.039?0.147△
|
|
化濁顆粒高劑量組
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10
|
5.7948E2?95.144△
|
1.166?0.128△
|
|
化濁顆粒低劑量組
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10
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6.6029E2?104.834△▲▲
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1.436?0.246△▲
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注：與空白組比較*P<0.01；與模型組比較△P<0.01；與羅格列酮組比較▲P<0.01，▲▲P<0.05
4.化濁顆粒對NAFLD大鼠FINS及IRI（HOMA-IR）的影響
由表4可以看出，大鼠經(jīng)造模后，模型組與空白組大鼠血清FINS及IRI值相比均有顯著性差異（P＜0.01），而FPG無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。治療后，羅格列酮組、化濁顆粒高、低劑量組與模型組相比有顯著性差異（P＜0.01），說明化濁顆粒組與羅格列酮組均能夠降低大鼠FINS和IRI。化濁顆粒高劑量組與羅格列酮組血清FINS及IRI比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），化濁顆粒低劑量組與羅格列酮組血清FINS及IRI比較有顯著性差異（P＜0.01），說明化濁顆粒高劑量組與羅格列酮組治療效果相當，均優(yōu)于化濁顆粒低劑量組。
表4 各組大鼠間FINS、IRI的比較（ ?s）
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組別
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動物數(shù)
（N）
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FINS
(uIU/mL)
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FPG
(mmol/L)
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IRI（HOMA-IR）
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空白對照組
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8
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6.928?0.963
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4.510?0.357
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1.398?0.248
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模型對照組
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10
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16.493?0.733*
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4.553?0.584
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3.344?0.363*
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羅格列酮組
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10
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11.046?1.059△
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4.756?0.362
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2.335?0.182△
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化濁顆粒高劑量組
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10
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11.515?1.722△
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4.715?0.434
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2.410?0.321△
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化濁顆粒低劑量組
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8
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13.170?3.328△▲
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4.848?0.393
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2.860?0.391△▲
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注：與空白組比較*P<0.01；與模型組比較△P<0.01；與羅格列酮組比較▲P<0.01。
5.化濁顆粒對NAFLD大鼠肝細胞脂肪變性的影響
大鼠肝臟組織HE染色，高倍鏡下觀察可知：空白組大鼠肝臟呈暗紅色，體積稍增大，組織切片表現(xiàn)肝索排列整齊，肝細胞胞漿紅染；模型組大鼠肝臟體積增大，薄膜緊張，邊緣圓鈍，呈奶黃色，有油膩感，組織切片表現(xiàn)脂肪變性的肝細胞腫脹呈圓形，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂肪空泡，肝索排列不整齊，在靠近小葉邊緣較明顯。化濁顆粒高、低劑量組與羅格列酮組大鼠肝臟呈淡紅色，體積增大，組織切片表現(xiàn)肝索排列整齊，肝小葉周圍有散在脂肪空泡。
三、討論
1.化濁顆粒對非酒精性脂肪肝病大鼠體重及肝指數(shù)的影響
肥胖是NAFLD的重要表現(xiàn)和病理因素，肝細胞脂肪變性、肝臟腫大是NAFLD的病理表現(xiàn)，減輕體重，消除肥胖，改善脂肪變性、減輕肝臟腫大是預防和治療非酒精性脂肪肝的重要手段。
本實驗表明：化濁顆粒大劑量組對非酒精性脂肪肝病大鼠的體重有減輕作用；羅格列酮組，化濁顆粒大、小劑量組均對非酒精性脂肪肝病大鼠肝指數(shù)有降低作用；與羅格列酮組比較，化濁顆粒大劑量組無統(tǒng)計學意義（P>0.05），說明化濁顆粒大劑量組在降低非酒精性脂肪肝病大鼠肝指數(shù)上的作用與羅格列酮相當。
2.化濁顆粒對非酒精性脂肪肝病大鼠血脂的影響
血脂異常是引起NAFLD產(chǎn)生和發(fā)展的主要原因。目前普遍認為脂肪肝的發(fā)病機制主要為：(1)進入肝內(nèi)的脂肪酸過多，TG的合成超過將其轉運出肝臟的能力；(2)肝內(nèi)脂肪酸β氧化障礙，肝內(nèi)脂肪酸利用減少，TG合成增加；(3)肝臟合成TG能力增強及脂蛋白代謝酶的活性下降[4]。由于上述原因致使過多的脂肪酸在肝細胞內(nèi)沉積，從而造成肝細胞脂肪變性。
本實驗表明：各組藥物均能有效降低TG、TC水平，化濁顆粒大劑量組與羅格列酮作用相仿（P>0.05）。在降低TG方面，化濁顆粒小劑量組作用不及化濁顆粒大劑量組及羅格列酮組。中藥制劑純度及劑型方面有待于進一步的提高，以發(fā)揮更好的降糖效果。化濁顆粒與羅格列酮都可改善非酒精性脂肪肝病大鼠的脂代謝紊亂。羅格列酮的作用機理為通過激活脂肪組織PPAR-γ，減少游離脂肪酸的形成，最終導致TG合成減少。結合有關研究推測，化濁顆粒的作用機理可能為減輕肝臟細胞脂肪變性，改善肝臟功能，提高肝臟分解TG、TC的能力。
3.化濁顆粒對非酒精性脂肪肝病大鼠FFA及TNF-α的影響
近年來的相關研究表明：FFA與TNF-α互相促進,引起肝臟脂質(zhì)蓄積、胰島素抵抗，從而影響和加重NAFLD的發(fā)生發(fā)展。
本實驗表明：化濁顆粒大劑量組對大鼠FFA與TNF-α的影響有和羅格列酮相似的作用，而化濁顆粒小劑量組的作用較差。
4.化濁顆粒對非酒精性脂肪肝病大鼠FPG、FINS及IRI的影響
近年研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有的NAFLD患者均伴有IR，F(xiàn)PG和FINS升高是IR的中間產(chǎn)物，同時也是IR的外在表現(xiàn)。我們用FPG和FINS的乘積除以22.5所計算出來的IRI是反映IR的一種方式。以這種方式計算出來的IRI與IR成正比例關系。
從實驗可以看出，化濁顆粒與羅格列酮組均能夠降低空腹血清胰島素和空腹血糖，降低胰島素抵抗指數(shù)。在降低大鼠空腹血清胰島素及改善胰島素抵抗方面，化濁顆粒大劑量組與羅格列酮組有相似的治療效果；在降低空腹血糖方面，化濁顆粒大、小劑量組作用略差于羅格列酮組。說明化濁顆粒和羅格列酮都可以改善胰島素抵抗[5]。結合有關研究推測，化濁顆粒改善胰島素抵抗可能是降低FPG和FINS，降低FFA與TNF-α，調(diào)節(jié)血糖及調(diào)節(jié)脂代謝紊亂等綜合因素所致。
5.化濁顆粒對非酒精性脂肪肝病大鼠肝細胞脂肪變性的影響
肝細胞脂肪變性是臨床診斷非酒精性脂肪肝病的金標準。
本實驗表明：化濁顆粒和羅格列酮均能在一定程度上改善肝細胞脂肪變性。從而對非酒精性脂肪肝病起到一定的治療效果。胰島素抵抗（IR）既能引起非酒精性脂肪肝病的發(fā)生，又能引起糖尿病的發(fā)生。積極治療非酒精性脂肪肝病伴IR，但尚未診斷糖尿病的患者，防止其糖尿病的發(fā)生，這正好體現(xiàn)了中醫(yī)的治未病與已病早治的思想，開展本藥對這個人群的實驗和臨床研究，將有深遠的意義。
參 考 文 獻
[1] MarchesiniG，BugiansiE，F(xiàn)orlaniG，et cd. Nonalcoholic fatty liver steatohepatitis，and the metabolic syndrome[J]. Hepatology, 2003, 23（9）:17-23.
[2] HanleyAJ，W illiam sK， Festa A, et a1. Livermarkers an d develop-ment of 24 themetabolic syndrome: the insulin resistance atherosclero-sis study[J].Diabetes，2005，54(11): 3140.
[3] 徐正捷，范建高，王國良，丁曉東，田麗艷，鄭曉英.高脂飲食致大鼠非酒精性脂肪性肝炎肝纖維化模型.世界華人消化雜志2002；10：392-396.
[4] 趙曉威.脂肪肝診斷和治療研究進展[J].中醫(yī)雜志, 2002, 43(12): 944.
[5] 趙文慧，韓德五，苗宇船等. 胰島素抵抗在非酒精性脂肪肝發(fā)病中的作用[J].山西醫(yī)科大學學報，2008，39（6）:500-503.
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